上海柏辰生物科技有限公司
 

新闻中心

NEWS

首页 >> 新闻中心 >> 生信篇 | Unicycler实战指南：驾驭二代与三代测序组装全流程

生信篇 | Unicycler实战指南：驾驭二代与三代测序组装全流程

来源: | 作者:/ | 发布时间: 2025-04-21 | 67 次浏览 | 分享到:

Unicycler是专为细菌基因组设计的组装工具，既支持纯二代(Illumina)或纯三代(Nanopore/PacBio)数据，也擅长混合组装。它融合了 De Bruijn 图（适用于短读段）和字符串图（String Graph，适用于长读段）两种策略，兼顾准确性与连续性。上一期我们详细介绍了Unicycler在混合组装中的应用，这期我们将带来Unicycler单独进行二代与三代组装的应用。

1

图片

Unicycler工作原理详解


二代数据组装流程

  • 图构建：拆分短序列为k-mer（默认k=21/33/55），构建 De Bruijn 图，通过寻找欧拉路径生成初步contig；

  • 纠错优化：借助 SPAdes 算法改良，结合桥接(bridging)与覆盖过滤，解决重复区段问题，提高组装连贯性。


三代数据组装流程

  • 初步组装：基于 Miniasm 快速构建重叠图；

  • 多轮校正：默认结合 Racon 进行3轮错误校正；

  • 自动闭环：识别染色质/质粒环状结构，输出完整闭环序列。

2

图片

操作流程与参数解析


数据准备要求

  • 二代数据：双端FASTQ文件，推荐覆盖度≥50x；

  • 三代数据：FASTQ/FASTA格式，推荐N50≥10kb，覆盖度≥30x。


常用命令示例

场景一：仅用二代数据组装

图片

  • --mode：组装模式（normal/bold/conservative）；

  • --min_fasta_length：设定输出Contig的最小长度。

场景二：仅用三代数据组装

图片

  • --keep：保留中间文件，便于后续调试与评估；

  • –min_polish_size：只对 ≥10 kb 的contig进行抛光。

3

图片

实战演练：E.coli基因组组装


数据信息

  • 样本：大肠杆菌E.coli K-12，基因组大小约4.6Mb；

  • 测序平台：

二代：Illumina NovaSeq PE150，覆盖度100x；

三代：Nanopore PromethION，N50=15 kb，覆盖度50x。


运行示例

二代数据：

图片

输出文件：

assembly.fasta：最终组装序列（含环化信息）；

assembly.gfa：组装图文件，可用Bandage可视化。

三代数据：

图片

若N50偏低，可加大 --racon_iterations 5以提高抛光轮次。

4

图片

结果评估与优化建议


核心评估指标

  • Contig N50：理想值应接近全基因组长度（~4.6 Mb）；

  • 闭环比例：检查 assembly.fasta 中 circular=true 标签；

  • BUSCO 完整性：目标细菌数据库中完整度 ≥95%。


常见问题及处理建议

  • Contig 碎片化：

二代：增加测序深度，调整 --min_kmer_coverage；

三代：尝试提高 --min_overlap（如设为5000）。

  • 嵌合体污染：使用BLAST或MUMmer对比参考基因组，排查异常区域。

5

图片

总结

在这两期推文中，我们详细介绍了 Unicycler 在微生物基因组组装中的应用场景、核心原理与实操策略，涵盖了 Illumina 与 Nanopore 等不同平台的组装优化方案。Unicycler 凭借其对 De Bruijn 图与字符串图的融合设计，以及自动纠错与环化输出机制，在原核基因组研究中表现出色。

后续我们将陆续推出以下专题，帮助大家从入门到进阶掌握二代/三代测序分析技能：

  • 三代数据质控与纠错工具详解（如 Filtlong、NanoFilt、Racon、Medaka）

  • 宏基因组组装与 binning 技术实战

  • 基于图的可视化分析工具（Bandage、IGV、Tablet）

  • 长短读混合组装工具对比（如 Flye、HybridSPAdes、MaSuRCA 等）

敬请关注，解锁更多生信实战干货！