飞摩尔级“细胞哨兵”:当智能生物传感器遇上ChemiDoc MP荧光成像

来源: | 作者:/ | 发布时间: 2025-06-12 | 34 次浏览 | 分享到:

智能生物传感器与合成生物学

新型生物传感器设计是合成生物学发展的一个重要分支和方向。通过合成生物学技术，生物传感器的生物识别元件和信号转换元件可被有效优化，提高灵敏度和特异性。经合成生物学设计的新型生物传感器可用于：

环境监测：利用合成生物学设计的生物传感器可以检测环境中的污染物，如重金属离子、有机污染物等。这些生物传感器可以被整合到微生物中，使其在污染环境中生存并发出信号，帮助监测和治理环境污染。
医疗诊断：合成生物学可以设计出能够检测疾病标志物的生物传感器，如检测血液中的特定蛋白质或核酸。这些生物传感器可以被整合到便携式设备中，实现快速、准确的现场诊断。
农业应用：通过合成生物学设计的生物传感器可以检测植物病原体或土壤中的营养物质，帮助农民及时采取措施，提高农作物的产量和质量。

其中，细菌监测器已被用于检测环境中的各种信号，例如：能感应TNT的细菌被用于探测地雷、记忆电路用于记录粪便样本中的水平基因转移、记忆电路用于诊断尿糖等。枯草芽孢杆菌是理想的“哨兵细胞”类型，可以在保持重组DNA完整性的同时存活数年。芽孢可以承受恶劣的条件，包括辐射、剪切应力、高温、高渗透压、缺氧条件、真空和氧化应激。

检测环境DNA的“哨兵细胞”

麻省理工学院的研究团队利用基因工程改造的芽孢杆菌设计了智能生物传感器“哨兵细胞”，来监测环境中的DNA序列，特别是人类DNA序列。这种技术有望在法医学、生态学和流行病学等领域发挥重要作用。他们设计的“哨兵细胞”将DNA摄取能力提高了3000倍，能够在背景DNA中检测到飞摩尔级别的目标DNA。

研究者展示了单个细胞或细胞群体能够同时记录多个不同的DNA序列。通过构建一个包含多个记录器的细胞，或者通过构建一个包含多个不同细胞的群体，每个细胞记录不同的序列，实现了对多个SNPs的同时记录，并且在细胞内被保护免受核酸酶的降解，即使在恶劣环境下也能保持数周。这一结果发表在权威期刊《Nature Chemical Biology》上（文献1）。

研究背景

环境DNA监测的重要性：

所有生物都会向环境中释放DNA，这些DNA可以用于追踪生物的存在，包括病毒、动物和植物。例如，通过监测环境中的DNA，可以追踪濒危物种、识别犯罪现场的嫌疑人或诊断农业病原体。

现有技术的局限性：

传统的环境DNA检测方法存在一些挑战，如需要连续采样、对非目标序列的干扰敏感、样本制备复杂、条件敏感、通量低和成本高等。

细菌哨兵的优势：

细菌哨兵可以作为长期监测环境DNA的工具，因为它们可以在环境中生存并记录DNA序列。特别是芽孢杆菌（Bacillus subtilis），它能够形成孢子，具有很强的环境耐受性，并且可以整合外源DNA到其基因组中。

“哨兵细胞”的构建

哨兵细胞基因组包含一个人类序列（蓝色），该序列包围着所需的SNP（黑色）。当人类DNA从环境中获取时，SNP（A）被记录在基因组中，并且由于终止子（TT）的切除，基因（gfp）得以表达。五个人类DNA序列，包含与面部形态相关的SNP。

参考SNP等位基因列于括号中。标签a和b分别表示上游和下游同源臂（SNP本身包含在a中）。超活性枯草芽孢杆菌SCK6的示意图，以及一组原生基因组编码基因（虚线框），这些基因由主调控因子ComK的过表达（包括自身调节）激活。

“哨兵细胞”对DNA的摄取

下图展示了作为“哨兵细胞”的超感受态枯草芽孢杆菌从环境中摄取DNA的原理及实验结果。

a，人类序列（a和b）被插入基因组。在摄取并整合包含表达盒两侧人类序列的外源DNA后，细胞发出荧光并对卡那霉素产生抗性。

b，数据显示了SEQ1gfp/kan的摄取和记录。其他四个序列的摄取情况显示在扩展数据图1中。“DNA记录频率”为Kanr+GFP+菌落形成单位 (cfu) 数除以菌落形成单位总数。

c，枯草芽孢杆菌S1-S5在木糖存在下对SEQ1gfp/kan-SEQ5gfp/kan的摄取数据。黑线为方程1的拟合曲线。

d，将枯草芽孢杆菌S1与相同的SEQ1gfp/kan质粒或线性产物孵育，比较了环状或线性DNA的摄取和整合情况。线性靶DNA序列上的同源臂a和b两侧分别连接了取自人类基因组的1kb序列（蓝色虚线框）。

“哨兵细胞”的报告基因

研究使用绿色荧光蛋白（GFP）和氯霉素抗性基因（camR）两种报告基因，分别用于快速荧光检测并提高灵敏度和特异性。这两种报告基因的结合使用，使得研究者能够准确地监测和记录目标DNA序列在哨兵细胞中的摄取和整合过程。

1.绿色荧光蛋白（GFP）

GFP被用于监测哨兵细胞是否成功摄取并整合了含有特定SNP的目标DNA序列。当目标DNA序列被整合到细胞基因组中后，GFP基因的表达被激活，细胞发出荧光，表明目标DNA序列已被成功记录。

2.氯霉素抗性基因（camR）

camR基因用于提高检测的灵敏度和特异性，通过选择性培养基（含有氯霉素）筛选出成功记录目标DNA序列的细胞，从而提高了检测的灵敏度。此外，camR基因的使用也减少了背景突变的干扰，提高了检测的准确性。

荧光菌落成像及验证DNA记录

实验中，Bacillus subtilis细胞被设计为在成功摄取并整合目标DNA序列后表达GFP。通过检测GFP的荧光信号，可以确定哪些细胞成功记录了目标DNA序列。使用ChemiDoc MP成像系统对培养皿进行成像，以观察和记录荧光信号。这有助于筛选出成功表达GFP的细胞，从而确认目标DNA序列的摄取和整合。

平板中挑取菌落，并分析终止子的存在。菌落1和2来自-DNA平板（均为GFP阴性），菌落3和4来自+SEQ#平板（但为GFP阴性），菌落5-8来自+SEQ#平板，且为GFP阳性。

ChemiDoc MP全能成像系统

Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系统具有独特的五通道荧光，波长覆盖从蓝、绿、红到近红外，具备完整的分子成像功能，如核酸凝胶成像、蛋白凝胶成像、Western Blot化学发光成像、WesternBlot多色荧光成像、红外荧光成像及免染成像，甚至具备切胶功能。ChemiDoc MP系统搭载了创新的CCD芯片及光学定焦镜头，保证了成像所必需的灵敏度与分辨率。