柏辰生活

Bio-Chain Life

细胞与细胞核的高通量单细胞RNA-Seq ——利用RNA-Seq创建基因表达谱

要点浏览:

• 突破传统单细胞测序的局限;

• 完整的单细胞测序解决方案,从细胞包被、加标签、文库构建到数据分析;

• ddSEQ的微滴可包被细胞尺寸在40~100μm的单细胞;

• ddSEQ的微滴可包被小于6μm的单细胞或细胞核;

 

复杂的生物系统依赖于单个细胞的协调活动,这些细胞的功能即使在单个组织内也可能有着显著的差异,但是要通过将数百万个细胞作为单个样品的常规技术来发现这种异质性是无法实现的。因为现有常规技术是先得到一份样本的总量,再通过平均化产生平均值,掩盖了细胞间转录的差异,并隐藏了对组织健康和发育至关重要的亚群的活动。为了更好地了解个体细胞对人类健康的贡献,并开发更有针对性的疾病治疗方案,因此在单细胞水平上对生物学进行表征成为至关重要的一步。


目前常用的单细胞转录组学的研究手段有:mRNA-FISH,单细胞RT-qPCR和单细胞RNA测序(RNA-seq)等。


▶ 传统单细胞技术的局限性

mRNA-FISH是基于显微镜的方法,其使用荧光标记的探针来计数固定细胞或组织中感兴趣的各个转录物。与其他单细胞检测方法不同,mRNA-FISH能够目标转录产物在组织或细胞中的空间分布信息,但与其他单细胞分析方法一样,mRNA-FISH在单个实验中可以分析的基因数量有限。由于每个靶标mRNA的种类需要分配一个特定光谱的荧光基团,所以同时检测的基因数量很少。


单细胞RT-qPCR允许研究更多的基因。当使用96孔板时,该方法可在多达96个细胞中分析1-10个基因。通过使用微流控芯片,可以将研究通量提高到96个基因X 96个细胞。但是这种方法也只能对已知mRNA进行检测。


mRNA-FISH和单细胞RT-qPCR均具有一个明显的局限性 - 它们都是针对已知转录本进行引物和探针设计的。这使得这些方法适用于检测预先选定的基因的表达模式,但不太适合发现新的生物标志物或与某生物学过程相关的未知转录表达情况。


由于传统技术手段的这些限制,新兴的单细胞RNA-Seq已成为单细胞分析领域颇具吸引力的方法。这种方法允许在单个实验中平行研究成千上万个细胞中数千个基因的表达,并且已被用于探究复杂生物学过程和生命现象,诸如组织和细胞的异质性研究、神经系统和干细胞类型的鉴定以及单细胞水平上疗效的评估等应用中1,2,3,4


然而,传统的单细胞RNA-seq方法要么受限于如何分离出单个大尺寸或单个小尺寸的细胞,或者受限于上游细胞分选的通量。而通过使用专有的微滴数字化技术来隔离单细胞,Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案克服了这些挑战,允许对更广泛的细胞类型进行大规模基因表达研究。


▶ 简单和可扩展的单细胞RNA-Seq工作流程

Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案使用Bio-Rad先进的微滴化技术在纳升级液滴中捕获单细胞以及细胞裂解和编码所需的所有试剂。每个单细胞在其各自的微滴中裂解,并且各个转录本(mRNA)结合上唯一的分子标签(UMI)。然后将所有液滴的cDNA合并用于第二链合成,随后使用Illumina的NEXTERA ®文库制备技术构建单细胞测序文库(图1)。

然后构建好的文库可以使用Illumina的MiSeq®,NextSeq®,HiSeq®,或NovaSeq®系统,并且得到的数据通过BaseSpace ®进行初级分析,若有更高级的分析需求可以使用FlowJo的SeqGeq软件。此单细胞RNA-seq流程允许每个样品检测数百至数千个细胞(图1)。

 

       图1.使用可扩展的Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案,单细胞易于分离和测序。UMI:独特的分子标识符。

 

▶ 挑战大尺寸细胞

传统单细胞RNA-seq方法的一个挑战是细胞大小。常规方法能够为10至25μm范围内的细胞产生高质量数据,但是大细胞如心肌细胞和脂肪细胞对单细胞RNA-seq来说则是个不小的挑战。Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案允许对这样大尺寸细胞进行样本处理、文库构建并产生高质量的测序数据:在一次实验中对尺寸为40至100μm的1,077个脂肪细胞进行检测,每个细胞检测到16,085个转录本(UMI),平均每个细胞检测到4,616个基因(图2A)。

 

图2.大尺寸细胞的单细胞测序。(A)使用Illumina Bio-Rad单细胞测序方案对尺寸为40至100μm的单个脂肪细胞进行单细胞测序实验。(B)该工作流程产生的高质量测序数据。

 

▶ 小尺寸细胞的高质量测序

单细胞RNA-seq的另一难点是小尺寸的物体,比如细胞核(<6μm)。现有的单细胞测序方法需要将新鲜组织或培养的细胞制备成单细胞悬液。对于难以解离的组织,如神经系统的细胞经过组织消化之后会对细胞的完整性及细胞的活性造成明显的影响。因此,对单个细胞核进行测序的能力对于了解人类神经系统和神经退行性疾病具有重要意义5


使用Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案进行RNA-seq,成功分离并测序548个单细胞核(图3A)。结果如预期,单细胞核所测到的转录本数据较完整细胞的少6(图3B)。

 

图3.小尺寸单细胞测序。(A)使用Illumina Bio-Rad单细胞测序方法对来自小鼠(3T3)或人(K562)的完整单细胞和细胞核进行测序。分离的细胞核产生的转录本数量大约是全细胞的一半。(B)在细胞核分离和测序之前,将小鼠(3T3,红色)和人类细胞(K562,蓝色)以一比一的比例混合。该混合物种实验中的低双重率(粉红色)表明,可以使用Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案成功分离和测序单核。

 

 

▶ 结论

Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案允许在更宽的尺寸范围内对单细胞/细胞核进行测序。此外,工作流程可灵活调整,以适应范围从数百到数千个细胞的实验。