全外显子测序在肿瘤免疫治疗中的意义及其在脑胶质瘤中的应用

　　近年来肿瘤免疫治疗为恶性肿瘤患者带来了新的希望，尤其是免疫检查点抑制剂治疗取得了很大的进展，但仍缺少预测疗效的标志物。基于测序技术分析肿瘤突变负荷、错配修复缺陷等是目前研究较多的免疫治疗标志物。随着新一代测序技术的发展，全外显子测序为上述分析提供了契机。现就全外显子测序在预测肿瘤免疫治疗中的作用综述如下，并分析其在脑胶质瘤免疫治疗中的应用进展。

　　一．肿瘤免疫治疗与全外显子测序

　　肿瘤免疫治疗已经成为继手术治疗、放疗和化疗之后的第4大肿瘤治疗方法，也是目前较热门的肿瘤治疗手段，其中免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目，在包括脑胶质瘤在内的多类型肿瘤中都开展了不少临床试验并获得了良好的临床疗效，具有代表性的便是CTLA－4、PD－1/PD－L1抑制剂。而在临床上，当前免疫检查点抑制剂遇到的主要困境是总体缓解率相对较低[1,2]。因此，寻找有意义的指示疗效的生物标志物显得尤为重要。肿瘤组织中PD－L1表达量水平是目前常用的诊断肿瘤患者是否获益于PD－1/PD－L1抗体治疗的分子标志物，但是后期实验发现高PD－L1表达水平的患者从PD－1/PD－L1抗体治疗中获益比例仅在50%左右，说明PD－L1表达量水平评估作为分子诊断标志物具有局限性。

　　二代测序技术正在不断改进，其中全外显子测序(wholeexomesequencing)可选择性的对人类基因组的编码区进行测序，揭示肿瘤基因突变特征，相比于全基因组测序，其低成本、高效率的优势日益显著[3,4]。近些年来，找寻合适的免疫治疗分子诊断标志物从未停止，除了上述提到的PD－L1表达量外，还有CD4和CD8T淋巴细胞活性，基因转录组分析以及基因突变分析等。利用全外显子测序技术获取肿瘤的基因突变特征，已然在预测免疫检查点抑制剂治疗中发挥了重要的作用。

　　二．肿瘤突变负荷

　　肿瘤突变负荷(tumormutationalburden,TMB)，又名TML(tumormutationload)，是指肿瘤基因组中平均1Mb(1兆碱基)范围内所包含的基因突变数量。基于全外显子测序计算肿瘤基因组去除胚系突变后的体细胞突变数量，即为TMB，可用非同义突变总数量或每1Mb的突变数量进行定量分析，10/1Mb的突变负荷等同于基因组编码区含有150个非同义突变[5]。然而这150个非同义突变中，最终可能也只产生1～2个肿瘤新抗原[6,7]。理论上，TMB越高能够被T淋巴细胞识别的新抗原产生也越多，更可能成为免疫治疗的靶点[8]。

　　研究者在2014和2015年分别对CTLA－4单抗治疗的黑色素瘤[9]和非小细胞肺癌患者[10]临床样本进行全外显子测序，发现高TMB患者能更好得从单抗治疗中获益。至此，越来越多的临床研究证实，PD－1/PD－L1等抑制剂治疗也与TMB呈正相关。一个超过10万人的肿瘤测序项目表明，几乎所有的肿瘤类型中均发现有高突变负荷患者[11]。这意味着肿瘤突变负荷能够用于肿瘤免疫疗法的伴随诊断。在胶质瘤中研究发现，TMB相比于黑色素瘤等对免疫检查点抑制剂敏感的瘤种偏低[12]，但是多项针对成人和儿童胶质瘤的测序分析都分别证实了胶质瘤中确实存在高TMB患者，并且TMB与胶质瘤世界卫生组织(WHO)分级存在正相关[13,14]。然而，高TMB患者中并未见更多的CD8T淋巴细胞浸润以及PD－L1的表达。所以，高TMB的胶质瘤患者是否可从免疫治疗中获益急待临床试验来验证。

　　当然，肿瘤突变负荷目前也并非是"金指标"。明显的不足就是当前没有统一标准的阈值可用于临床评估。主要原因是肿瘤突变负荷在不同癌种中分布不同[15]。总之，利用全外显子测序计算肿瘤突变负荷并结合其他标准，可作为肿瘤免疫治疗的辅助诊断标准。

　　三．错配修复缺陷与微卫星不稳定

　　错配修复(MMR)基因是一种高度保守的看家基因，具有修复DNA碱基错配，保证DNA复制高保真性，有利于维持基因组的稳定性[16]。微卫星序列(MS)，又称简单重复序列，是一些短而重复的DNA序列，一般由1～6个核苷酸组成，可连续重复20～60次甚至更多。DNA甲基化或基因突变致MMR基因缺陷，从而导致微卫星重复序列长度的改变，此现象称为微卫星不稳定性(MSI)。主要表现为：当肿瘤细胞出现一个或多个错配修复蛋白缺失时，即为错配修复基因缺失(dMMR)，表现为高频度微卫星不稳定(MSI－H)；当肿瘤细胞无错配修复蛋白缺失，可判读为错配修复基因无缺失(pMMR)，表现为低频度微卫星不稳定(low－levelMSI，MSI－L)或微卫星稳定(MS－S)。因此，错配修复缺陷与微卫星不稳定在肿瘤进展中属于伴随关系。MSI较早发现于结直肠癌患者中，但是目前研究表明MSI普遍存在于各类癌症患者中[17]。

　　最初，抗PD－1/PD－L1免疫治疗在结直肠癌中的研究显示，仅1例患者得到了缓解，而在2015年Le等[18]发现，抗PD－1抗体在dMMR的结直肠癌患者中反应率显著提高。随后PD－1抗体对12种dMMR肿瘤的治疗效果评估，同样显示了更多的临床获益[19]。这些都提示，虽然肿瘤来源不同，但由于在基因水平存在dMMR这一共性，因此对同一种治疗模式有效。原因可能是dMMR引起的MSI诱发了更多的基因突变，释放更多新抗原，使肿瘤细胞更易被机体免疫系统识别，阻断PD－1/PD－L1通路可以解除微环境中存在的免疫抑制状态，提高免疫杀伤肿瘤效应[20,21,22,23]。同时，研究也证实了dMMR可以激活免疫系统，在dMMR结肠癌组织中常伴有更多的淋巴细胞浸润和富含细胞因子。此外，dMMR肿瘤微环境更易表达PD－L1等，提示或许该类肿瘤更加适用于PD－1单抗免疫治疗。近期的一项单中心回顾性研究对224例结直肠癌患者进行测序，计算相应的肿瘤突变负荷，并同时利用免疫组化检测MMR相关蛋白，发现193例pMMR患者突变数<20；而在突变数≥20的31例患者中28例(90%)属于dMMR，这也说明了TMB与dMMR存在一定联系，联合两者或可提高预测效果[24]。利用TCGA数据库中配对的初发和复发胶质瘤全外显子测序结果分析，证实了存在dMMR和MSI，尤其是在复发胶质瘤中发生频率增加[25,26]。同时，在胶质瘤中dMMR也和TMB存在一定相关性。虽然有研究发现dMMR与胶质瘤放化疗有一定联系[27]，但是在免疫治疗方面未见相关报道。目前，美国食品药品监督管理局(FDA)已批准Keytruda(抗PD－1)用于所有具有MSI－H或者dMMR实体瘤患者的治疗，成为一种不分肿瘤类型、仅考虑肿瘤标志物的治疗药物。

　　目前，常用的筛查MMR表达有无缺失的方法有2种：免疫组化检测MMR相关蛋白的表达，以及PCR检测多个微卫星位点以判断有否存在MSI。有研究显示，利用二代测序技术检测dMMR优于IHC和PCR，表明了全外显子测序判断dMMR和MSI以指导免疫治疗的意义。

　　四．拷贝数变异

　　拷贝数变异(CNV)是一种大小介于1kb～3Mb的DNA片段的变异，广泛分布于人类基因组中，其覆盖的核苷酸总数大大超过单核苷酸多态性(SNPs)的总数，丰富了基因组遗传变异的多样性。对于全外显子测序来说，其本身设计是用来检测点突变的，由于实验与基因数据分析技术的局限，全外显子CNV分析存在假阳性。目前，有多种分析软件及算法可利用全外显子测序数据预测CNV，通过互相对比分析，可降低假阳性。对TCGA数据库中367例黑色素瘤病人的生存数据进行分析表明存在基因拷贝数变异的患者生存时间更短，表明了CNV在肿瘤进展中的意义。同时，有研究者对16例接受ipilimumab(抗CTLA－4)治疗的黑色素瘤患者进行了全外显子测序数据分析，在不应答治疗者中发现了142个基因拷贝数变异，且主要分布在IFNγ信号途径上[28]。2017年的一项研究明确报道了拷贝数变异与免疫治疗疗效关系，提示单臂/整条染色体的拷贝数变异的患者免疫治疗疗效较差，并且联合TMB能更好得预测免疫治疗[29]，而全外显子检测数据包含这部分的内容。CNV在胶质瘤中较为常见，如7号和10号染色体的缺失[30,31]，但与免疫治疗效果的相关性目前仍缺少相应的临床证据。

　　五．潜在的免疫治疗标志物

　　肿瘤突变中95%的突变是点突变(substitutions)，其余包括插入/删除突变(insertion/deletion)，或移码突变(frameshift)。插入/删除及移码突变蛋白序列和结构都会产生较大改变，与原编码序列差异更明显，更易与MHC分子结合，被T细胞识别为新抗原的可能性更大[6]。黑色素瘤患者中对CTLA－4抑制剂持续应答者的肿瘤新抗原具有共同保守的4肽序列表位，与病原体序列非常相似，易于被T细胞识别，这可能是黑色素瘤患者对免疫检查点抑制剂治疗敏感的真正原因，而不是单纯的TMB高[9]。然而TMB越高，出现4肽序列表位的可能性也就越高。由于各瘤种的突变类型完全不一样，利用全外显子测序分析基因突变方式，预测肿瘤免疫治疗或可有效。

　　基于全外显子测序分析获得的肿瘤突变负荷，还可以用于对肿瘤新抗原的预测并计算新抗原负荷，而肿瘤新抗原的累积与特征往往也与免疫检查点抑制剂治疗获益相关，并且对免疫疫苗、过继性细胞治疗等的设计也有很大帮助，所以肿瘤基因组突变负荷的检测在肿瘤精准免疫治疗中有着很大的应用价值。此外，肺癌中发现携带部分基因突变的患者，如TP53等，其TMB更高。目前的研究也显示，TMB高的患者常缺少经典的驱动基因突变；而TMB低的患者通常与驱动突变并存，包括EGFR突变等，说明通过全外显子测序得到突变基因，并且分析与TMB之间的关系也将是预测肿瘤免疫治疗的方向。

　　六．展望和结论

　　以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗将肿瘤治疗带入了一个全新的时代，但是仍需寻找一种有效的免疫治疗标志物来预测疗效。全外显子测序相比于传统全基因组测序技术，其低花费、高产量已成为明显的优势。利用全外显子测序揭示肿瘤基因层面的变异特征，包括肿瘤突变负荷、错配修复缺陷/微卫星不稳定和拷贝数变异等数据指标，或可为寻找免疫治疗预测标志物带来新的希望。而上述研究在脑胶质瘤免疫治疗中仍旧欠缺。现有的、甚至是未来的胶质瘤免疫治疗临床研究中可设计全外显子测序流程，分析以上突变特征在预测胶质瘤免疫治疗中的意义。