近日，宾夕法尼亚大学的华人学者XuXiaowei和GuoWei发现肿瘤内的癌细胞会产生携带压制T细胞活性的PD-L1的外泌体，这种外泌体从肿瘤组织中直接散播到全身各处，对人体的免疫系统进行全面的打击和压制。再一次，外泌体重重的落在了科学家们的心中！今天呢，我们就来看一下如何检测外泌体。
针对小颗粒（比如外泌体）的研究一直以来都是据具挑战性的。通过流式细胞术的方法检测外泌体主要的挑战来自于：仪器本身的电子噪音、电压的设定、鞘液的纯净程度和机器对不同群体的识别分离度。但是，性能卓越的ZE5流式细胞分析仪可以克服这些困难，并且可以实现不依赖于微球检测外泌体。
外泌体是一种直径约为50-100nm的分泌型膜泡，主要参与细胞内通讯，在细胞转移和抗原呈递等过程中也起着关键作用。由于外泌体会进入所有主要体液（包括血液和尿液）中，并携带重要的细胞信息，因此它们最近成为潜在生物标志物的新来源。但是由于它们比细胞体积小，因此难以表征和研究。
一般通过流式细胞术检测外泌体需要手动调整硬件、严苛的仪器校准、数小时的鞘液净化和复杂的数据分析。ZE5高端流式细胞分析仪实现了简化的工作流程，消除了当前外泌体研究的这些障碍（图1）。通过使用ZE5的内置功能，实验室都可以研究外泌体和其他小颗粒。无关染色方法、表面还是囊内标记，ZE5都能显示出对小颗粒识别的较佳灵敏度。
在这篇文章中表明ZE5可以轻松的检测到外泌体的表面标记蛋白CD63和CD81以及囊泡内标记ALIX和TSG101。而且ZE5具有许多独特的功能助力小颗粒检测。
方法和结果
样品制备
MCF-7细胞用含10％FBS和0.01mg/ml胰岛素的MEM培养基培养，直至达到70-80％密度。用PBS洗涤细胞两次，并与无外胚层培养基一起孵育12-72小时。收集培养基并通过0.22μm膜过滤以除去细胞和碎片。将过滤的培养基与0.5体积的TotalExosomeIsolationReagent（LifeTechnologies）彻底混合。将混合物在4℃孵育过夜，然后在4℃下以10,000g离心1小时。吸出上清液，用PBS洗涤沉淀，通过0.1μm膜过滤。外泌体的蛋白浓度和大小通过NanoDrop分光光度计（ThermoScientificInc.）和ZetasizerNanoZSPDedicatedZetaAnalyzer（MalvernPananalytical）测定为185-300nm。
图1.ZE5检测外泌体的工作流程
仪器设置
鞘液使用的是ProFlowSortGradeWater（Bio-RadLaboratories）。使用ZE系列QC珠（Bio-RadLaboratories）进行QC。使用0.22-1.35μm的黄色荧光微球（Spherotech）的混合物来设置仪器电压和阈值（图2），可以使用单阈值或双阈值来设置阈值。对于外泌体表面标志物的检测，用来自405nm激光和散荧光信号的FSC作阈值。对于囊泡内标记物和基于珠子的外泌体检测用来自405nm激光的FSC作阈值。
图2.仪器设置。A，ZE5配备极低噪音的电子元件，并提供405nm激光的小颗粒光电倍增管（PMT）探测器。B，ZE5允许用户选择执行单阈值门控。C，或使用双参数阈值排除更多碎片和电子噪音信号。D，ZE5鞘液可以使用去离子超纯水，系统自带过滤器，以帮助小颗粒分析。E，使用0.22μm珠子，在来自405nm激光器的小颗粒检测器（SPD）和前向散射（FSC）上设置双阈值（C），使用黄色荧光微球（0.22-1.35μm）来设定电压。
基于非微球的外泌体表面染色
用来检测外泌体的所有溶液通过0.1μm滤膜过滤。用于表面和囊内染色的所有应该抗体经过滴定。外泌体表面染色：将2μg外泌体加入含50μlCD63-FITC（Bio-RadLaboratories）和CD81-APC（BioLegend）的PEB缓冲液（PBS，5mMEDTA和0.5％BSA）中，室温孵育30分钟。然后将样品用PEB洗涤并重悬于500μlPEB中。在上ZE5检测前，将染色样品通过10μm过滤器过滤。如图3所示，设置未染色的对照，易于检测外泌体的表面标志。
囊泡内染色
胞内固定和破膜缓冲液（eBioscience）用于外泌体囊泡内染色。将2μg外泌体在100μlIC溶液中固定，室温下避光孵育20分钟后，用1ml破膜液洗涤样品两次，然后重悬于100μl破膜液中。然后使用ReadiLink抗体标记试剂盒（Bio-RadLaboratories）将ALIX连到494nm激发516nm发射标记染料及TSG101-PE（Abcam）连同样本室温下孵育30分钟。孵育后，用1ml破膜缓冲液洗涤样品两次，并重悬于500μlPEB中（图4）。
传统基于微球的外泌体检测
传统的流式细胞术使用基于微球的方法来检测外泌体，因为它们在大多数流式仪上很难检测到。这里采用的SureBeadsProteinGMagneticBeads（Bio-RadLaboratories）大小为2.4-3.4μm。将CD63（10μg，Bio-RadLaboratories）与100μlSureBeads在室温下旋转孵育10分钟。将孵育后的微球与10μg外泌体在室温下孵育1小时。然后用含有0.1％吐温20的PBS洗涤三次，并重悬于250μl含0.1％吐温20的PEB中。将50μl用外泌体包被过的SureBeads与CD63-FITC（Bio-RadLaboratories）和CD81-APC（BioLegend）在室温下孵育30分钟，并用PEB-0.1％Tween20洗涤两次。图5表明在ZE5上使用基于微球的方法成功表征了外泌体的表面标志物。
