在临床、兽医诊断以及食品安全领域，利用RT-qPCR技术对不同病原体进行定量和分型是非常常用的实验手段。该技术具有多种优势，如灵敏度高，快速，多重检测，通量高和成本低等。然而，当检测病原体时，并非所有RT-qPCR试剂都能获得理想的结果。为此，我们向大家推荐一种新型一步法多重RT-qPCR预混液（Reliance one-step multiplex RT-qPCR supermix），可同时对病原体RNA和DNA靶标进行多重检测！
Reliance One-Step Multiplex Supermix预混液能够在一次反应中灵敏且准确地检测多达五种靶标。该预混液包含一种新型酶Reliance Reverse Transcriptase，是FLV（Feline leukemia virus，猫白血病病毒）和MMLV（Moloney murine leukemia virus，莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶的嵌合酶。Reliance Reverse Transcriptase与强大的DNA聚合酶以及专业配方相结合，赋予预混液无与伦比的性能及稳定性。用Reliance One-Step Multiplex Supermix制备的反应体系可以在室温下放置更长时间而不损失对目标检测的灵敏度。
我们设计了如下实验同时对RNA和DNA靶标进行五重检测：三种病毒核酸模板，其中两种为RNA模板，分别来源于寨卡病毒（Zika, ZIKV）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）；另一种为登革热病毒（Dengue virus，DENV）的DNA模板；内部阳性对照（IPC）RNA模板以及人源基因组DNA对照。三种病毒模板稀释为五种浓度梯度，同时对照模板浓度保持恒定。利用微滴式数字PCR对病毒RNA靶标的拷贝数进行测定，并在其最低稀释系列中将每个反应稀释至单拷贝或更低（表1）。我们配制了两块相同反应体系板，每板包含每个样品的10个技术重复; 立即上机检测第一块板（时间（T）= 0小时），而将第二板在室温（25℃）下储存并在第二天（T = 24小时）进行上机检测。
表1.五重检测的靶标及模板情况
图1.DNA和RNA模板五靶标共检测结果。
Reliance One-Step Multiplex Supermix室温下保持稳定
如图1所示，我们观察到在t=0小时（实心圆）和t=24小时（加号）产生的数据之间存在显著的一致性。T=0小时和T=24小时的检测点通常重叠，这表明在室温下将反应体系放置一天后，该体系仍然稳定。稀释系列中检测到的病毒核酸量与预期结果一致，具有良好的扩增效率和R2值（表2）。在两个时间点都能检测到所有五种样品不同稀释浓度的靶标病毒（表2）。
表2. 不同试剂在两个时间点检测不同浓度稀释样品的结果对比
当使用较少RNA模板（每个反应体系单拷贝或更少）时，并非所有技术重复的样本都是阳性。例如，基于泊松分布，平均每个反应有一个RNA拷贝时，在10个技术重复中应有6-7个阳性结果。这种分布在ZIKV模板5个log浓度稀释中观察到，在该稀释度下每个技术重复中预期有1.17个RNA拷贝（表3），检测结果中，10个技术重复有7个在t=0小时和t=24小时时呈阳性，与预期完全一致。同样，在一个技术重复中的两个时间点检测到平均预期只有0.15个RNA拷贝的CHIKV病毒（表3）。这些结果表明，即使在反应体系配置24小时后，Reliance One-Step Multiplex Supermix也能以接近100%的扩增效率检测单拷贝RNA。
表3. 不同试剂在24小时内的两个时间点检测到不同浓度及重复的ZIKV和CHIKV病毒结果比较
我们还对比了其他公司的一步法试剂。在t=0小时，公司A和B的产品都有检测到病毒靶标（表2和表3）。但是，公司A的试剂对CHIKV的扩增效率较差，仅检测到CHIKV 5个浓度稀释样品中的3个以及ZIKV 5个浓度稀释样品中的4个。公司B的试剂表现优于公司A，但仍未能检测到CHIKV最低稀释度的样品（表3）。然而，在t=24小时时，两家公司的试剂性能都显著下降（表2和表3）。这证明了Reliance One-Step Multiplex Supermix的独特性，因为它即使在室温下24小时后仍能保持高灵敏度和扩增效率。在筛选大量样本时，此功能非常关键，因为高通量工作流程可能涉及多个样品板的连续检测。采用在室温下稳定的试剂无需对配置好的体系进行冷藏，从而实现更简单的自动化解决方案。
Reliance One-Step Multiplex Supermix可以同时检测和定量五个靶标，具有卓越的扩增效率和单拷贝检测的灵敏度。此外，还可以有效地对RNA和DNA靶标进行共检测，从而开发出可同时检测不同病原体（如RNA病毒、DNA病毒、细菌、酵母）的方法。最后，利用该试剂配置的反应体系在室温下保持稳定，与Bio‑Rad的CFX自动化系统和两台CFX实时定量PCR系统结合起来时，可最多检测40块样品板，从而实现更简单、可重复的自动化工作流程。
