靶向PD-1和PD-L1的免疫检查点抑制剂已用于非小细胞肺癌（NSCLC）的临床管理。FFPE样本中PD-L1高表达会提高NSCLC病人对PD-1抑制剂的反应率。当前对PD-L1表达水平的评价基于肿瘤组织样本的免疫组化分析。在临床实践中，如果能获得肿瘤FFPE样本，通常会优先用于评估恶性细胞的有无、NSCLC的组织学分型，检测是否存在对TKI药物敏感的特定EGFR突变以及ALK、ROS1重排。而PD-L1的表达评价往往依赖于是否剩下足够且完整的FFPE样本。
澳大利亚RMIT大学的研究人员建立了基于Bio-Rad QX200 微滴式数字PCR（ddPCR）的多重RT-ddPCR方法，可快速而准确地定量分析有限样本中的多个生物标志物（MMP9:TIMP3比值和PD-L1表达量），在一个反应中鉴定NSCLC组织样本中的恶性细胞并定量检测PD-L1的表达水平（图1）；并且ddPCR能克服qPCR技术的局限，可对mRNA拷贝数进行绝对定量而无需对照组织样本，使得研究人员能建立量化的Cut-off值以确定微小NSCLC组织样本中恶性细胞的存在，同时对PD-L1的表达进行定量测定。
图1. 三重ddPCR的2-D散点图
MMP9探针分别以FAM和VIC标记，1:1混合；TIMP3探针以FAM标记；PD-L1探针以VIC标记。图中显示7个明显的阳性微滴簇。
研究人员使用该多重ddPC和免疫组化对88例NSCLC病人组织标本（48例腺癌，40例鳞癌）和20例对照肺组织样本进行了分析，评价所建立的多重ddPCR方法的诊断性能。
如图2所示，多重ddPCR方法测得MMP9:TIMP3比值在NSCLC组织样本中显著高于非成对对照组（p<0.0001）和成对对照组（p<0.01）。ROC曲线分析提示MMP9:TIMP3比值分析的AUC为0.945（0.88-1.0, p<0.0001）。当Cut-off设置为0.028时，检测灵敏度为98.9%，特异性特异性为80%，表明多重ddPCR方法有卓越的诊断性能。
图2. 多重ddPCR平台分析NSCLC样本和对照组的MMP9:TIMP3比值
如图3所示，多重ddPCR平台测得PD-L1:TIMP3比值只在鳞癌中相比对照组显著增加（p<0.05），而腺癌相比对照组无显著差异。Spearman分析显示PD-L1:TIMP3比值与PD-L1肿瘤细胞IHC染色相关，而跟PD-L1免疫细胞IHC染色相关性弱。
图3. 多重ddPCR平台分析NSCLC样本和对照组的PD-L1:TIMP3比值
ROC曲线分析显示多重ddPCR在区分PD-L1低表达（<50%，IHC）和高表达（>50%, IHC）样本时，对于腺癌样本的AUC值为0.961（0.9-1.0），鳞癌样本的AUC值为0.926（0.8-1.0）（图4）。将Cut-off值设定为>0.104，通过PD-L1:TIMP3比值检出NSCLC中PD-L1高表达阳性IHC染色样本的灵敏度和特异性分别为90%和89%。
图4. ROC曲线分析多重ddPCR平台对于PD-L1:TIMP3比值检测的诊断性能
本研究建立的多重ddPCR检测体系能从有限的组织样本（如EBUS取样）中检测PD-L1的表达水平，并能同时检测其他靶标突变，减少重复侵入性活检的必要。研究团队认为该多重ddPCR方法可整合进日常的EBUS获得的少量新鲜组织样本检测中，并在样本采集24-48小时内完成检测，还可进一步实现自动化。
随着新的肿瘤靶向药物和免疫治疗方法的出现，与之相关的标志物也不断涌现。Bio-Rad作为数字PCR领域的行业翘楚，紧扣医疗实践的需求和动向，一直引领着数字PCR平台方法学和应用的开拓与进步，保持了在业内较为强大的ddPCR产品研发和迭代的能力，持续推出了针对各种肿瘤标志的经过充分验证和质控的ddPCR检测试剂盒产品。
