2020年，dMIQE指南进行了更新，以简化dPCR实验的可重复性。与qPCR一样，为最大限度提高dPCR性能，实验设计时需考虑无偏性和可重复性。以下内容概述了dPCR实验Assay（本文指某检测体系引物探针的组合）设计和优化。
dPCR引物探针序列设计的原则要求与qPCR相仿。虽然长产物也可以被定量，但一般建议产物片段小于150bp。探针的化学信号（如水解探针，最好是非荧光淬灭剂）或DNA结合染料（如EvaGreen）可以在qPCR和dPCR平台兼容。
如果要评估真核细胞中的基因表达，请将引物设计在跨外显子-外显子交界处，以避免扩增来自纯化步骤中可能引入的污染基组DNA
检查正向引物和反向引物的3互补序列，因为可能会有引物二聚体的形成
使用任一在线工具（如Primer-BLAST）验证特异性，以确认感兴趣的靶标是唯一的
在大多数应用中，探针应≤30个核苷酸。如果探针较长，可考虑使用内部淬灭剂
确保探针的5'末端不含G。如果5'末端存在G，即使在水解后也能淬灭荧光
如果要评估真核细胞中的基因表达，请将探针或引物设计成跨越外显子-外显子连接点的探针或引物
通过Primer-BLAST运行探针序列比对工具，以确保该序列对您感兴趣的靶标是唯一的
退火温度及引物探针浓度的测试中，最好使用与待测模板一致的模板进行分析优化，因为结果可能因模板不同（例如质粒、基因组DNA、无细胞DNA、合成DNA）而有差异。此外，虽然相同序列探针的不同批次合成可以改变最终荧光强度，但这对测量结果的影响可以忽略不计，因为基质效应或抑制剂可能会影响阳性信号的荧光强度，但“次优”结果也可以得到与“最优”结果一致的拷贝数结果，这也反应出该平台的稳定性。不过我们还是应该努力提升阳性信号和阴性信号的最大峰值分辨率，减少阴阳性信号之间的散点（“落雨图”）。
多重dPCR的设计同样类似于qPCR多重设计，引物探针数量（重数）增加需要额外考虑序列间的互补配对，以避免非特异性杂交或二聚体形成。在进行多重设计时，应优先考虑使用多通道进行区分。多通道分析可以提高分析效率，减少样本使用量，并可以在单个反应中进行内部质控。多重分析还有其他优点，例如在分析拷贝数变异时，成对的目标基因和内参基因可使用双通道同时检测同一样本。类似的，在使用水解探针分析单核苷酸突变或插入/缺失时，使用双通道也是首选方法。使用“drop-off”分析方法时，基因型是通过单、双阳性信号簇来进行分析的，使用单通道则无法完成。
双色分析也可用于识别一些可能难以通过单色分析识别的技术瑕疵。例如，当使用单色分析时会发生向另外通道的荧光渗透（或称为信号串扰或溢出），如果双重检测实验在各自通道中单独显示微滴（编者案：即1D通道图），荧光渗透微滴可能被显示为附加簇（编者案：即被误认为是荧光拖尾）而误认为分析特异性降低（如图Fig.1）。在多通道中，荧光渗透清晰地表现为单个正极分区从预期轴向双正极分区的预期位置“倾斜”或“升高”（Fig.2）。荧光渗透可以在双检测通道中通过使用仅含单引物探针和单一靶向模板的测试，如果信号簇“倾斜”或“提升”到另一个“荧光轴”区域，则为渗透。可以通过降低相关探针的浓度、改变荧光集团和/或应用颜色补偿矩阵来减少渗透。
如果清楚原因，荧光渗透通常是可以容忍的。如果使用单荧光通道检测时渗透现象消失，说明可能是其他原因引起的，例如Assay的特异性降低（造成的）。探针与相似序列（例如在单核苷酸突变检测中）非特异性结合，使特异性变低。虽然这可能很小，但可能会出现类似荧光穿透的“倾斜”或“提升”（Fig.3），从而降低结果的峰值分辨率。当突变体的其中一种占主导时，cfDNA中的罕见突变会由于“PCR错误造成的假阳性”因素而限制最低检出丰度（Fig.4）。
当微滴包裹了同一位点的野生和突变的模板时，在双阳性区域微滴中会发生引物对的竞争反应，竞争同一对引物后，相比于单一模板的微滴，阳性信号会由于竞争反应而降低。即便使用单通道读取结果，竞争反应也同样会发生并使信号峰降低。使用“drop-off”方法时，竞争反应使得双阳性微滴中呈现双信号簇，可以使用前面概述的优化和质量控制方案来评估分区特定的竞争（PSC）、荧光渗透和其他因素的影响。
1、GB-T 42077-2022生物技术核酸靶序列定量方法的性能评价要求qPCR法和dPCR法
2、The Digital MIQE Guidelines Update:Minimum Information for Publication of QuantitativeDigital PCR Experiments for 2020
