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数字PCR应用于结直肠癌甲基化检测

来源: | 作者:/ | 发布时间: 2024-09-02 | 614 次浏览 | 分享到:

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC) 

全球男性第3、女性第2常见恶性肿瘤 

死亡率全球癌症第4位

每年约69.4万人因此丧生


对于早期CRC患者，多数可以治愈，5年生存率可达90%，而晚期患者则不足10%。结肠镜检查被认为是预防结直肠癌的金标准，但是其昂贵的价格和侵入性特征，以及需要肠道准备等因素，导致了患者依从性差。同时还存在着出血穿孔、漏诊等隐患。粪便潜血试验灵敏度和特异性高，但受药物和饮食的影响很大。而且多数CRC患者确诊时已到中晚期，早期CRC缺乏典型临床症状不易察觉，因此有效的早期诊断方法可以降低CRC的发病率和病死率，提高患者生存率。



许多研究表明，检测循环肿瘤DNA(ctDNA)中的DNA突变和异常甲基化可以为早期结直肠癌筛查提供新的方法。DNA甲基化可以通过改变基因表达来影响肿瘤发生。肿瘤特异性DNA甲基化出现在肿瘤发展的早期。血浆SEPT9启动子区甲基化已在结直肠癌中进行了广泛的研究，研究表明SEPT9甲基化用于诊断结直肠癌的灵敏度在48.2％到95.6％之间，特异度在69％到97.1％之间。SEPT9甲基化已经被证实是结直肠癌血浆检测的高度灵敏和特异性的生物标志物，并且于2016年获得了美国食品药品监督管理局(FDA)的批准。但是SEPT9也在其他癌症血浆中例如肺癌，头颈部癌症，胃癌中均呈现不同程度的高甲基化。因此，用于结直肠癌早期诊断的ctDNA特异性甲基化生物标记物仍有待进一步研究。



ctDNA在cfDNA中的占比在0.01％到60％不等，其浓度和肿瘤体积、分期、血管化、增殖率和细胞死亡率相关。因此要对ctDNA甲基化水平实现灵敏可重复的检测是一项巨大的挑战。目前SEPT9检测试剂盒使用的是将甲基化特异性PCR(MSP)与TaqMan探针结合的检测方法，称MethyLight，其可以在校正DNA载量和标准化甲基化DNA标准品后，以相对方式定量甲基化等位基因的量，大大提高了检测和定量甲基化等位基因的能力。然而，MethyLight仍然容易受到PCR抑制剂的影响，在未甲基化等位基因背景下检测稀有甲基化等位基因的灵敏度有限，并可能在标准化过程中出现偏差，这可能导致结果不一致，尤其是在检测低水平的DNA甲基化方面（包括低浓度和低分子量）。因此，常规的甲基化特异性定量PCR通常不能达到准确检测低水平DNA甲基化并以此作为癌症生物标志物的灵敏度。



数字PCR(droplet digital PCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其最初被定义为单分子模板PCR扩增，其将样品分离成单个分子并通过PCR扩增；通过终点信号的存在来判断阴性和阳性，结合泊松分布来计算原始样品中的拷贝数；数字PCR受扩增效率及PCR抑制物的影响较小。有研究显示数字PCR可以从背景DNA中检测到0.001％的靶基因突变。Ming等人证明相比于常规MethyLight PCR，MethyLight ddPCR的定量下限(LOQ)降低25倍，检测限(LOD)降低20倍。因此MethyLight ddPCR是一种更适合于检测ctDNA甲基化水平的技术。


数字PCR甲基化检测流程

01

引物及探针设计

选择与癌症特异性/灵敏性高的肿瘤标志物；针对筛选的位点，例如Septin9、BMP3、SDC2、RAFF1A等设计甲基化引物探针及非甲基化引物探针。

02

从样本中提取核酸，获得待测DNA

03

对DNA样品进行甲基化处理

使用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation‑Lightning Kit试剂盒对获取的DNA样本进行甲基化处理，具体步骤如下：

1、将20μl核酸提取产物与130μl的Lightning Conversion Reagent加入到200μl的离心管中；


2、放入PCR仪中处理：98℃ 8min；54℃ 60min；


3、向收集柱中加600μl的M‑Binding Buffer，在加入150μl的步骤2产物，轻轻颠倒几次，10000xg离心1min；


4、弃收集管中液体，向收集柱中加100μl的M‑Wash Buffer，10000xg离心1min；


5、弃收集管中液体，向收集柱中加200μl的L‑Desulphonation Buffer，静置15min，10000xg离心1min；


6、弃收集管中液体，向收集柱中加200μl的M‑Wash Buffer，10000xg离心1min；


7、将收集柱放入到1.5ml离心管中，向收集柱中加10μl的M‑Elution Buffer，  10000xg离心1min。

04

配置PCR反应液

以甲基化处理后的核酸为模板配置20μL的PCR反应液，PCR反应液为基于数字PCR方法的结直肠癌甲基化检测用PCR反应液。

05

制备反应微滴

将配制好的20μL PCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8 cartridge)sample孔中，再加入70μL微滴发生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200 TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。每个微滴发生卡一次可同时完成8个样品的微滴制备，用时约2.5min。

06

PCR扩增

将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板对应的反应孔中，用铝膜热封(180℃,5 sec)后，于普通PCR仪上进行扩增。

07

扩增结束采用阅读仪进行结果读取


总结与展望

随着肿瘤表观遗传学研究的深入，可以用作肿瘤诊断的新型生物标志物被不断拓展。DNA甲基化作为新的生物标志物应用于临床上的微创诊断、预后评估、预测治疗反应、监测病情等方面，不断展示其可能的潜在应用价值，为CRC筛查和早期诊断提供了不同于传统方法的全新手段，极具开发和临床应用潜力。


参考文献


1、 Combined SEPT9 and BMP3 methylation in plasma for colorectal cancer early detection and screening in aBrazilian population，Cancer Med. 2023 Aug;12(15):15854-15867. doi: 10.1002/cam4.6224. Epub 2023 Jun 20.

2、 Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209-249

3、 国家癌症中心中国结直肠癌筛查与早诊早治指南制定专家组.中国结直肠癌筛查与早诊早治指南(2020, 北京)[J].中华肿瘤杂志,2021,43(01):16-38.

4、 Analysis of DNA methylation in cancer:location revisited .Nat RevClin Oncol .2018；15(7):459-466

5、 MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles .Epigenetics .

2015；10(9):803-9 .