随着合成生物学的飞速发展，利用基因工程微生物治疗癌症的想法逐渐从科幻走向现实。加州理工学院的科研团队成功开发出一种超声可控的工程菌，为癌症免疫治疗带来了全新的希望 [1] 。
肿瘤独特的免疫抑制微环境，为细菌的定植和释放治疗载荷提供了有利条件。然而，传统微生物疗法存在的安全隐患，如细菌在健康组织中释放治疗物质可能带来的危害，一直是阻碍其广泛应用的难题。而此次研究中，科研人员巧妙地利用聚焦超声（FUS），为这一困境找到了出路。
这种超声可控的工程菌以大肠杆菌Nissle 1917为底盘，通过精心设计的基因回路，实现了对治疗活性的精准控制。
表征大肠杆菌Nissle 1917中温度敏感阻遏物行为的遗传线路图解
研究人员筛选出对温度敏感的转录阻遏蛋白TcI42，将其与基于整合酶的状态开关相结合。在生理温度（约37°C）下，TcI42抑制相关基因表达；当受到短暂的聚焦超声热刺激（42°C-43°C）时，TcI42抑制解除，触发一系列反应，使工程菌持续释放治疗物质。
为优化线路切换而进行的高通量筛选中所针对的位点图。用于筛选线路变体的复制板的代表性荧光图像（ChemiDoc MP成像GFP蛋白表达）。将培养板在指定温度下孵育1小时，然后在37°C下继续孵育，直到菌落长到足够大以便进行分析。橙色圆圈表示选择用于进一步分析的示例菌落。
为了进一步优化治疗效果，科研人员还对基因回路进行了深入改造。他们通过随机和理性设计，筛选出具有最低基线活性和最高诱导活性的线路变体。在此基础上，将抗CTLA-4和抗PD-L1纳米抗体等免疫检查点抑制剂的基因融入线路。这些纳米抗体能够有效阻断CTLA-4和PDL1信号通路，激活免疫系统对肿瘤细胞的攻击。
细胞在37°C、42°C或43°C下诱导1小时，然后在5ml培养基中于37°C下扩增24小时，然后收集培养基并测定αCTLA-4纳米抗体的释放。
在小鼠癌症模型实验中，这种超声激活的工程菌展现出了惊人的疗效。当肿瘤生长至一定体积后，向小鼠静脉注射工程菌。两天后，利用聚焦超声刺激肿瘤部位。结果显示，接受治疗的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，与未接受超声刺激或仅注射野生型大肠杆菌的对照组相比，肿瘤体积增长缓慢。而且，这种治疗方式具有高度的空间特异性，工程菌的激活主要局限于肿瘤部位，对肝脏、脾脏等健康组织的影响极小。
评估体内微生物抗肿瘤免疫疗法的激活实验
这一研究成果的意义不仅在于为癌症治疗提供了一种全新的、有效的手段，更在于其为未来的生物医学研究开辟了广阔的道路。聚焦超声激活的细菌疗法有望应用于多种难以手术切除的癌症，如头颈癌、卵巢癌、胰腺癌和脑肿瘤等。
在本项研究中，ChemiDoc MP用于细菌在培养板上的荧光成像实验，以确定转录因子的诱导效果。ChemiDoc MP用于评估经过优化的基因回路在不同温度下的表现。通过测量荧光强度，研究者能够量化基因回路在37°C和42°C时的激活程度。实验结果表明，经过优化的基因回路在42°C时能够显著提高细胞的激活比例，同时在37°C时保持较低的泄漏表达，这对于确保治疗的特异性和安全性至关重要。
此外，ChemiDoc MP还用于常规Western Blot实验，来检测经过热刺激后，工程化细菌释放αCTLA-4纳米抗体的情况。
在37°C条件下，细菌没有释放αCTLA-4纳米抗体。这表明在正常体温条件下，细菌的基因回路处于关闭状态，不会产生治疗性蛋白。
在42°C条件下，细菌能够可靠地释放αCTLA-4纳米抗体。这表明在热刺激下，基因回路被成功激活，导致治疗性蛋白的表达和分泌。
在43°C条件下，细菌同样能够可靠地释放αCTLA-4纳米抗体，进一步确认了基因回路在较高温度下的激活效果。
Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系统具有独特的五通道荧光，波长覆盖从蓝、绿、红到近红外，具备完整的分子成像功能，如核酸凝胶成像、蛋白凝胶成像、Western Blot化学发光成像、WesternBlot多色荧光成像、红外荧光成像及免染成像，甚至具备切胶功能。ChemiDoc MP系统搭载了创新的CCD芯片及光学定焦镜头，保证了成像所必需的灵敏度与分辨率。
图片来源：DOI: 10.1038/s41467-022-29065-2
