揭秘WB | 细胞裂解方法大比拼：如何根据不同样品类型选择合适的方案？

Western Blot——样品制备篇

样品制备的目的是从细胞或其他样品中提取和溶解蛋白，去除污染物并将总蛋白浓度调节至合适的上样范围，主要涉及以下步骤和操作：

细胞裂解是指蛋白释放到溶液中的过程。不同的生物材料，从不同细胞结构分离蛋白，需要不同的裂解方法。应使用适当的化学抑制剂并控制温度，最大限度地降低蛋白酶和其他降解或修饰蛋白的酶活性。

要想成功的进行PAGE电泳，必须首先将蛋白溶解到缓冲体系中。可使用含有变性剂、去污剂、还原剂、缓冲剂以及电泳体系兼容的增溶溶液。通过加入抑制剂并保持样品低温，防止蛋白被降解或修饰。

上样前，需要通过蛋白测定法确定样品中蛋白质的浓度，调整浓度以进行电泳分离。过高的上样量会导致凝胶过载，过低的上样量会导致条带信号过弱。

在Western Blot实验中，我们常常遇到不同类型样品需要进行蛋白的释放，如培养的哺乳动物细胞、植物细胞、组织、酵母、细菌等。下面，我们介绍几种常见的细胞裂解方法。

除垢剂剂可以溶解易破裂的细胞，如血细胞或组织培养细胞。NP-40等非离子型除垢剂温和且不变性，但溶解疏水蛋白能力较低。两性离子除垢剂(如CHAPS)和离子除垢剂(如SDS)可有效增加蛋白溶解性，并使蛋白变性。

使用匀浆器、超声波仪或组织研磨使细胞受力破碎。超声处理等方法会产生热量，从而使样品过热，因此，需使用冷却方法以避免样品过热。例如，在超声处理期间，可将样品浸入冰浴；使用研钵和研杵研磨样品时，需添加液氮保持样品低温。通常会同时使用化学破碎法和机械法来最大限度释放样品中的蛋白质。

使用可消化植物或细菌细胞壁的酶对细胞进行裂解处理。例如，纤维素酶和果胶酶(植物细胞)、裂解酶(酵母细胞)溶菌酶(细菌)。酶处理之后通常会再使用另一种破碎方法继续处理，如超声。

小技巧：无论采用何种细胞破碎方法，均应除去所有不溶物，以免堵塞凝胶孔洞，上样前离心（15℃下20000xg，持续15分钟）。