数字PCR定量分析技术是通过将DNA分子分配到独立的反应室，并在每个反应室中进行PCR扩增反应后，对阳性荧光信号进行检测，实现DNA分子的定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测等方面有着广泛应用前景。
理想状况下，ddPCR（Droplet digital PCR）可检测到0.01%的突变。以Bio-Rad QX200数字PCR为例，理论情况下可生成20,000个微滴，当突变频率＜0.01%时，理论上阳性微滴可能只有0-2个，统计的不确定性极大。考虑增加液滴数量，在数学上是可行的，但设备复杂度和成本都可能随之增加。因此如何进一步提高数字PCR检测低频突变的灵敏度是精准医学和液体活检领域的重要研究方向。以下介绍几种可行的方法。
游离DNA（cfDNA，包括循环肿瘤DNA ctDNA）的浓度是影响数字PCR检测灵敏度的关键因素之一。首先可增加血浆输入量（如 4–10 mL血浆），对于超低浓度样本（如早期癌症），可尝试多管合并提取以提高检出率。其次对于已抽提好的低浓度cfDNA我们可以采取浓缩方式提高样本浓度，从而提高上样量。浓缩的方式有多种，比如用纯化试剂盒重新纯化后减少洗脱体积，也可以使用浓缩仪直接浓缩，但浓缩方式对于样本浓度的提升是有限的。同时要注意的是，纯化试剂盒可能会造成目标模板的丢失，浓缩仪会使样本整体的纯度变差，因此无限制的浓缩反而会造成后续PCR扩增抑制，进而影响低频检测。
图1：浓缩前T790M检测结果
（浓度0.776ng/ul，最大体积上样，只检测到1个阳性微滴）
图2：浓缩后T790M检测结果
（同一个样本浓缩后浓度1.29ng/ul，最大体积上样，可检测到2个阳性微滴）
锁核酸探针（Locked Nucleic Acid, LNA）是一种通过化学修饰的核酸类似物，其独特的结构赋予其在分子检测中显著的优势，尤其在提高灵敏度、特异性和稳定性方面表现突出。LNA探针可显著扩大完全匹配与错配序列的Tm值差异（ΔTm >15℃），精准识别SNP（单核苷酸多态性）和低频突变（如肿瘤cfDNA 、ctDNA中的0.01%突变）。在qPCR或数字PCR中，LNA探针的非特异性结合减少，信噪比提高。故在检测体系中引入LNA探针可在一定程度上提高低频突变的检出。
图3：EGFR基因L861R突变（0.5%）不加LNA修饰的检测结果（仅突变）
图4：同一样本L861R突变（0.5%）增加LNA修饰的检测结果（仅突变）
通过富集模板即在线性范围内同比例富集突变和野生型，用富集模板做ddPCR，从而避免了由于样本中的DNA片段的含量过低，低于数字PCR最低检测水平，从而造成假阴性的检测结果。
通常情况下，数字PCR的单孔反应总体系一般在20uL，单孔生成的微滴总数介于10000-20000之间，限制了单个孔的检测样本总拷贝数在10万拷贝以内（可根据基因组大小与样本总质量换算）。面对十万分之一以下的低频突变的检测（那么意味着待测样本的总质量超出了单孔检测的上限），除了上述提到的方法，可采取的另外一种检测和分析策略是将待测样本均分成几个等份（保证每孔样本投入量不超过单孔上限），分成几个反应孔同时进行数字PCR检测，最终将同一样本对应的反应孔的数据叠加查看，也可以得到更低丰度的突变检出。
图7：T790M位点0.005%突变频率分四孔检测
除了上述四种方法外，还有减少背景干扰，例如选择性去除野生型DNA、CRISPR-Cas9 靶向切割野生型DNA、利用sgDNase（一种精准的DNA分子剪切工具）特异性去除基因组中的高背景野生型链等方法。但此类方案通常处理复杂且成本较高，不利于常规使用。
提高低频检出，本质上就是提高低丰度样本的扩增效率，跟聚合酶的扩增效率、引物探针的扩增效率（在保证特异性的前提下）、检测样本的纯度和上样总量都相关。没有完美和一劳永逸的方案，在充分考虑可操作性、成本等多种因素的前提下，希望能为大家目前遇到的实验困境带了一些灵感。后续会持续推出我们在实践过程中的一些感悟心得，欢迎大家批评指正。综上，尽管数字PCR在检测低频突变方面还有提升的空间，但目前仍是液体活检中认可度最高的技术手段之一。
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