在科研的道路上，WB实验如同一场精密的蛋白质“寻宝之旅”，每一个步骤都至关重要。然而，许多初学者在实验过程中遇到的常见问题，往往都与样品制备环节细节把控不足有关。选择合适的裂解液和还原剂、添加蛋白酶抑制剂、正确使用缓冲液，是提升实验可重复性和结果准确性的必要手段。因此，掌握蛋白质溶解和稳定化的技巧，不仅有助于提升实验效率，更能为科研成功的可靠性打下坚实基础。
为确保电泳顺利进行，必须有效消除蛋白质之间的聚集作用。理想的做法是在电泳样品缓冲液中同步完成细胞裂解与蛋白溶解。若无法实现这一操作，则需在专门的增溶溶液中提取蛋白，该溶液应包含去垢剂、变性剂和/或还原剂，并使用与电泳兼容的缓冲体系。裂解缓冲液通常含有多种去垢剂，有助于破坏细胞结构、释放蛋白质并促使其充分溶解。然而，由于不同蛋白质的理化性质各异，其对缓冲液成分及去垢剂的响应也可能存在差异。若目标蛋白未能有效溶解，或其蛋白-蛋白相互作用具有特殊性，则需尝试其他特制缓冲液，并通过置换或去除原有去垢剂来优化溶解条件。
全细胞裂解物和膜结合蛋白：常用的裂解缓冲液包括RIPA和NP-40。其中，RIPA因其较强的裂解能力，特别适用于提取难溶性膜蛋白。
核/线粒体蛋白：通常优先选择RIPA缓冲液，但为提高特定细胞器及目标蛋白的回收效率，常采用分级分离策略以增强富集效果。
细胞质蛋白：在某些情况下，Tris-HCl缓冲液可能比RIPA更具优势，具体条件需通过实验优化，以实现目标蛋白的最大化提取。
天然状态蛋白质：CHAPS作为一种两性离子去垢剂，能有效维持蛋白质的天然构象，因此广泛应用于等电聚焦（IEF）和二维电泳（2-D PAGE）等需要保持蛋白天然状态的技术中。
多种蛋白质可通过二硫键交联形成多聚体结构。添加还原剂能够有效断裂这些二硫键，促使蛋白质解聚为单体形式。以下是几种常用的还原剂及其典型应用场景。
细胞裂解后，胞内酶类（如蛋白酶和磷酸酶）仍具有活性，可能导致目标蛋白发生降解、去磷酸化或构象改变。为最大限度抑制这些酶的活性，样品制备过程应全程在冰上或4℃环境下进行，并在裂解缓冲液中添加相应的蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂。此外，裂解缓冲液建议现用现配，以确保其有效性。实验人员既可选用市售的即用型复合抑制剂（通常为专利配方），也可根据具体实验需求自行配制抑制剂混合液。下表汇总了常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂、各自的作用靶点，以及在裂解缓冲液中的推荐终浓度。
防止降解：离心混合后，应立即加入裂解缓冲液及蛋白酶抑制剂混合物，以有效抑制蛋白水解。为获得较高的蛋白提取效率，有时需采用不同浓度的蛋白酶抑制剂组合，并重复裂解步骤。
定量样品：测定样品中总蛋白含量有助于确保各泳道上样量一致，从而实现均等电泳加载。在需要比较不同处理组（如对照与实验组）中目标蛋白表达水平时，准确的定量尤为重要。保持上样量一致可减少后续数据分析中的归一化误差。
去除不溶物：固体颗粒可能堵塞凝胶孔道，影响电泳效果。因此，在电泳前需将裂解后的细胞匀浆在15°C下以20,000 ×g离心15分钟，以充分沉淀并去除所有不溶性成分。
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