想要扩增曲线稳定又漂亮？跟着这份qPCR实验操作 × CFX Opus 96上机攻略做！

a. cDNA：100 ng - 100 fg / 反应

b. 基因组DNA：50 ng - 5 pg / 反应

a. 全程避光：SYBR Green染料光敏，操作与放置必须避光。

b. 避免反复冻融：建议分装使用，减少冻融次数。

c. 冰上快速操作：试剂含热启动酶，室温放置过久影响特异性。

d. 充分混匀：Supermix使用前必须颠倒混匀，禁止剧烈震荡。

e. 先配Mix，后加模板：降低引物二聚体与非特异性扩增。

f.  必须设置 NTC 无模板对照：排除体系污染。

g. 体积精准：使用校准移液器，保证体系均一性。

h. 必须去气泡：离心去除气泡，避免荧光信号干扰。

CFX Maestro 软件操作基本步骤如下：

a. 设置热循环程序文件(Protocol Tab)

点击Edit（编辑）或 Create New（创建新程序），根据 Supermix 进行相关参数设定。

图1 cDNA参数设定

图2 gDNA参数设定（注：建议使用98℃处理基因组DNA模板，以确保完全变性）

较短的退火/延伸时间(1-10s)适用于扩增产物长度小于100bp的情况。较长的退火/延伸时间(40-60s)则适用于扩增产物长度大于250bp、富含GC或AT序列的目标、粗制样本或需要较高输入量（例如 100ng cDNA 或 50ng 基因组DNA）的情况。

b. 设置样品板文件(Plate Tab)

根据本次实验的荧光染料种类，选择相应预设好的快速样品板设置文件，染料法选择 Quick Plate_96 wells_SYBR Only.pltd；探针法选择Quick Plate_96 wells_All Channels.pltd。

然后单击 Edit Selected（编辑选择文件）或 Create New（创建新文件）进行样品信息的编辑。

c. 运行实验(Start Run Tab)

单击 Start Run，根据提示保存文件，开始运行程序。